細胞凍結保存におけるトレハロースの応用に関する研究: 脂肪由来幹細胞の凍結保存

前号では、ヒトオリゴデンドロサイト前駆細胞 (OPC) の凍結保存におけるD ()-トレハロース二水和物の使用に関する研究を共有しました。 この研究は、D ()-トレハロース二水和物を添加した凍結保存培地がOPCの長期凍結保存に適しており、細胞回収率の改善に役立つと結論付けました。

この号では、脂肪由来幹細胞 (ADSC) の凍結保存におけるD ()-トレハロース二水和物グリセロールの凍結保護剤 (CPA) の研究を見てみましょう。創傷治癒を促進するため。

創傷治癒を促進するためのADSCの凍結保存におけるD ()-トレハロース二水和物グリセロールのCPAの研究

1. ADSCsおよびCryoprotectants

脂肪由来幹細胞 (ADSC) は、脂肪原性、骨原性、軟骨原性細胞などの中皮起源の細胞に分化する可能性があり、免疫抑制効果もあります。再生医療および難治性免疫障害の治療において臨床応用の見通しがあります。 ADSCの研究は、医学界のホットな研究分野の1つになっています。

現在のADSC療法の問題の1つは、ADSCの効率的かつ安全な凍結保存です。 従来のCPAは10% DMSO + 90% FBSである。 ただし、DMSOは細胞毒性があり、組織のDNAメチル化プロセスを妨害するため、細胞の長期凍結保存におけるDMSOの使用はアポトーシス率を高める可能性があります。一方、FBSには、人獣共通感染症ウイルスを導入したり、アレルギー反応を引き起こしたりする可能性のある異種動物由来のタンパク質が含まれています。 したがって、このCPAは臨床使用には適していません。

上海交通大学医学部に所属する第9人民病院の研究者が予備で発見In vitroで1.0 mol/L D ()-トレハロース二水和物20% グリセロールの複合CPAは、細胞の生存率に統計的差異を示さなかったという実験、従来のCPAと比較してADSCの凍結保存に使用した場合の細胞増殖能力は、移動能力は大幅に優れていました。

研究者はさらに調査しましたIn vivoマウス創傷モデルの上記の複合CPAで凍結保存された解凍後ADSCの生物学的影響。

2.CPAの準備

① 複合CPA (試験群): 1.0 mol/L D ()-トレハロース二水和物20% グリセロール、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS、pH 7.4) の溶媒。

① 従来のCPA (対照群1): 10% DMSO + 90% FBS。

① 正常な生理食塩水 (対照群2): 凍結保護剤なし。

CPAは使用前に準備され、0.22μmフィルターを通して濾過された。

3.研究結果

① 細胞の生存率と形態:

複合CPAで凍結保存された脂肪由来幹細胞 (ADSC) は、解凍後も良好な細胞生存率と形態を維持しました。 テストグループ、コントロールグループ1、および新鮮なADSCグループ全体で、細胞の生存率に有意差はありませんでした。 上記の3つのグループからのADSCの細胞形態は、インキュベーターで72時間培養した後も基本的に同じままでした。

① 創傷治癒率:

マウスの創傷モデルの創傷に、複合CPAで凍結保存されたADSC、新鮮なADSC、および通常の生理食塩水をそれぞれ注入した。

7日目に、複合CPAの創傷治癒率は対照群2と比較して有意に高く、新鮮なADSC群と比較して有意差はなかった。

14日目に、3つのグループの創傷治癒は同じ傾向に従いました。

① 創傷再上皮化とコラーゲン沈着への影響

14日目には、顆粒組織が形成され、コラーゲンが均一かつ整然と分布していた試験群と新鮮なADSC群で、創傷の再上皮化が良好でした。 結果は、複合CPAで凍結保存されたADSCが、新鮮なADSCと同様に、創傷の再上皮化とコラーゲン沈着を促進する生物学的機能を持っていることを示しました。

① 血管新生能力への影響

血小板内皮細胞接着分子としても知られるCD31は、主に内皮細胞の存在を実証し、血管新生を評価するために使用されます。 CD31の免疫蛍光染色は通常、治療中に感染組織の血管新生を観察するために行われます。

7日目および14日目に、CD31の免疫蛍光染色を創傷組織に対して実施し、定量的データを収集した。 結果は、複合CPAで凍結保存されたADSCと新鮮なADSCの両方が血管新生を効果的に促進できることを示しました。

4.ディスカッション

創傷治癒は、細胞、成長因子、細胞外マトリックス、神経、および血管間の相互調整を含む動的で複雑な病理学的プロセスです。

脂肪由来幹細胞 (ADSC) は、成人間葉系幹細胞の一種であり、コラーゲン沈着、さまざまなサイトカインのパラクリンを介した組織の血管新生を促進することができます。創傷治癒を促進するために免疫調節に参加します。 さらに、ADSCは上皮細胞、ケラチノサイト、皮膚線維芽細胞に分化することができ、創傷治癒を直接促進します。

ADSCは通常、外科的処置によって得られる。 ADSCの多系統分化の可能性は、ドナーの年齢が上がるにつれて大幅に減少します。 若いドナーから1回の手術で入手したADSCを凍結保存し、必要に応じて複数回使用すると、患者の治療費を大幅に削減できます。そして、治療結果に対するドナーの年齢の影響を減らすことができます。

この研究では、マウスの背側創傷モデルを使用して、解凍後の凍結保存されたADSCと新鮮なADSCの治療効果を比較しました。 結果によると、複合CPAで凍結保存されたADSCは、解凍後の新鮮なADSCと同じように創傷治癒を促進する能力を示しました。 ADSCの凍結保存に1.0 mol/L D ()-トレハロース二水和物20% グリセロールの複合凍結保護剤を使用しても、In vivo細胞の生物学的機能。

複合凍結防止剤は、さまざまなメカニズムを通じて細胞凍結中に補完的な保護効果を発揮できます。

D ()-トレハロース二水和物は、非透過性の凍結保護剤として、比較的分子量が低く、細胞表面に保護膜を形成し、細胞への凍結損傷を軽減します。 ただし、D ()-トレハロース二水和物は細胞膜に浸透できず、その保護効率が制限されます。

透過性凍結保護剤としてのグリセロールは、溶液の粘度を上げ、氷の結晶形成を減らすことで保護的な役割を果たし、D () を助けることができます。-トレハロース二水和物は細胞膜に浸透し、D ()-トレハロース二水和物の保護効果を改善します。

この研究は、D ()-トレハロース二水和物グリセロールの安全で非毒性の複合CPAが、凍結中のADSCの生存率と生物学的機能を効果的に保護できることを示しました。そして、細胞が解凍後の新鮮なADSCと同じ組織再生を促進する効果を持っていることを確認してください。 これは、生物学的に安全な幹細胞凍結保護剤であり、臨床応用の見通しが優れています。