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ファイザー/BioNTechのCOVID-19ワクチンのEMAレビューレポートによると、ワクチンBNT162b2の活性物質の製造は5つの重要なステップで構成されています。 その中でも、RNA分子は線状DNAから合成されます。In vitroで転写 (IVT)
続いてマルチステップの浄化とろ过。
レポートは、スポンサーが出発物質の適切な微生物制御を確実にするためのテスト戦略を実施し、バッファー製剤中のHEPESバッファーがRNaseを含まないことを推奨しました。
添加剤の仕様に関して、報告書は、加工助剤のエタノールとクエン酸バッファーは、欧州薬局方 (Ph。ユーロ。) 、HEPESバッファーとEDTA仕様が活性物質の仕様に対して設定されています。
以上から、Pfizer/BioNTechは、mRNA COVID-19ワクチンの製造にHEPESバッファーを使用しました。 レビューレポートはまた、HEPESバッファーがRNaseフリーである必要性を強調しました。
2016年にBioNTechによって発表されたLPX-mRNA製剤に関する論文に基づいて、HEPESバッファーが同社のmRNAストック溶液で使用されました。 BioNTechは、mRNA COVID-19ワクチンの製造中にRNAストック溶液のバッファーシステムとしてHEPESを使用したと推測できます。
HEPESは、RNAポリメラーゼのIVTと密接に関連している可能性があるmRNAストック溶液中のバッファーとして使用された。
IVT反応のためのHEPESバッファー対の使用は、早くも1987年の研究で報告されました。 この研究では、感染性造血壊死ウイルス (IHNV) のRNAポリメラーゼを、異なる反応条件下でIVTについて調査した。 結果は、HEPESバッファーがTrisバッファーと比較してIVT効率を最大化できることを示しました。
研究は、と比較して、トロメタミンTRISバッファー、HEPESをバッファーとして使用した場合 (図1a) 、RNA合成は3倍高く、HEPESバッファーの最適濃度は400 mMであった。
インペリアル・カレッジ・オブ・サイエンス・テクノロジー・アンド・メディシンの感染症部門のディレクターであるロビン・シャトックは、mRNAワクチンの分野で権威ある専門家であり、BioNTechと緊密に協力しています。PNIおよびその他の主要なバイオ医薬品企業。 彼のチームは2021年にsaRNAのIVTの最適化に関する論文を発表し、IVT反応のバッファーとして40 mM HEPESを使用するとIVT効率の向上に寄与すると述べました。 結論は、saRNAのIVTに影響を与える主要な要因をスクリーニングおよび調査することによってなされた。
2016年にBioNTechが発表したLPX-mRNA製剤に関する論文によると、同社のmRNAストック溶液で使用されているバッファーはHEPESでした。 この研究では、HEPESバッファーを使用して1 mg/mLのRNAストック溶液を準備することによってRNA-LPXを準備しました。
関連文献によると、HEPESにはIVT反応のバッファーとしての利点があります。これが、BioNTechがmRNAストック溶液のバッファーシステムとしてHEPESバッファーペアを使用している理由です。
1.HEPESのpKaは温度によってほとんど変化せず、pHは温度によってほとんど変化しない。
2.特性は安定しています。 一方で、HEPESは、他のイオンと複雑化せず、他のイオン機能に影響を与えます。他方で、他のイオンの存在はHEPESの緩衝能力に影響を与えません。
3.細胞培養培地のpHは、主に重炭酸塩と5% COによって維持されます2媒体で。 セルがオープン环境にあるとき、CO2エスケープは、生理学的範囲外のpHの急激な上昇につながる可能性がありますが、それはissではありませんHEPESバッファペアを補足したメディアのためのue。
4. HEPESはバイオフィルムを容易に横断することができず、細胞内の生化学反応を妨げない。
1.ピペラジン部分の存在により、H2O2HEPESが光にさらされたときに生成されます。光は培養細胞やその他の生物学的に活性な物質に有毒です。 HEPESは、レドックス感受性物質と組み合わせて使用しないでください。 バッファーとしてのHEPESは、直射日光の外で使用する必要があります。
2. HEPESは、生化学的生成物において10〜25 mMの濃度で一般的に使用される。 濃度が10 mM未満の場合は緩衝能力が弱く、濃度が高い場合は一部の細胞に毒性作用を及ぼす可能性があります。
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参考文献:
1. GAEL KURATH * t、LEONG J C。 感染性造血性壊死ウイルス、魚ラブドウイルスのinvitroでの転写 [J]。 Journal of general virology、1987(68): 1767-1771。
2. Samnuan K、Blakney AK、McKay PF、ShattockRJ。 体外転写における実験の設計収量自己増幅RNAの最適化。bioRxiv; 2021。
3. EMA評価レポート、一般名: COVID-19 mRNAワクチン (ヌクレオシド修飾)。
