細胞凍結保存におけるトレハロースの応用: マウス精巣胚芽細胞の凍結保存

前の2つの問題では、ヒト由来のオリゴデンドロサイト前駆細胞 (OPC) の凍結保存のためのD ()-トレハロース二水和物の使用に関する関連研究を共有しました脂肪由来幹細胞 (ADSC)。 これらの研究では、一定量のD ()-トレハロース二水和物を凍結保存培地に添加するか、D () の複合凍結保護剤を使用することがわかりました。-トレハロース二水和物グリセロールは、長期凍結保存後の幹細胞の回復率を改善し、したがって、病気の治療または創傷修復のための幹細胞のその後の臨床応用に貢献する可能性があります。

この号では、マウスの精巣胚芽細胞の凍結保存を例として、生殖補助医療の分野におけるD ()-トレハロース二水和物の適用の見通しを調査します。

未熟マウスの精巣胚芽細胞の凍結保存に対するさまざまな凍結保護剤の影響

精巣胚芽細胞の凍結保存の背景

近年、生殖補助医療の急速な発展に伴い、ますます多くの不妊男性が子孫を産むことが可能になっています。 その過程で、生殖関連細胞の長期凍結保存は、成功率に影響を与える重要な技術的困難の1つになっています。

たとえば、思春期前の癌男性患者の場合、性腺毒性による治療は生殖能力の永久的な喪失につながる可能性があります。そして、低温での精巣組織または細胞の長期凍結保存は、それらの生殖能力を維持するための重要な手段です。

しかし、全身性腫瘍の患者の場合、解凍後の凍結保存された精巣組織の自家移植は、癌細胞の再導入のリスクをもたらします。 癌細胞は精巣細胞懸濁液から分離でき、精子幹細胞 (SSC) をin vitroで培養して丸い精子への分化を誘導できることを考えると、子孫を産むことは、精子注射によって達成することができます。

したがって、癌の思春期前の男性患者にとって、精巣胚芽細胞の長期凍結保存は、男性の生殖能力を維持するための重要な方法の1つであり、潜在的な臨床応用価値があります。

河南省人民病院のZhangXiaolongや他の研究者は、2週齢のマウスを使用して、思春期前のヒトの未熟な精巣組織の発達状態をシミュレートしました。マウスの精巣細胞を凍結保存するためにさまざまな凍結保存プロトコルを採用し、最良の凍結保存方法を模索しました。

異なる低温保護剤の効果の比較

この研究では、凍結保存培地は、さまざまな成分に応じて次の5つのグループに分けられました。

マウスの精巣生殖細胞懸濁液は、2段階の酵素加水分解によって調製され、調剤され、5つの異なる凍結保護剤のそれぞれをそれぞれ添加した後、極低温バイアルに移されました。 極低温バイアルはプログラムされた凍結を受け、2か月後に液体窒素タンクから取り出され、細胞生存率、アポトーシス率、およびミトコンドリア膜電位を検出するために回収されました。

研究結果

① 凍結保存前後の細胞生存率と回復率

凍結保存前のものと比較して、凍結保存後の細胞生存率は5つのテストグループすべてで減少しました。 その中で、グループEの細胞生存率と回復率は、他の4つのテストグループよりも有意に高かった。

(2) 凍結保存後の細胞回復

各グループで、凍結保存後の精巣細胞の回復率は、解凍後の解離および凍結保存された精巣組織4 mgから実際に回収された生存細胞の数に基づいて定量的に評価されました。 結果は、グループEで回収された細胞の数が他の4つのテストグループのそれよりも有意に高かったことを示した。

① アポトーシス率

アポトーシス率は、各群のフローサイトメトリー (FC) により検出した。 その結果、コントロール群と比較して、各試験群においてアポトーシス率が有意に増加したことが示された。 5つのテストグループでは、グループEのアポトーシス率は他の4つのテストグループよりも有意に低かった。

① ミトコンドリア膜ポテンシャル

対照群と比較して、凍結保存細胞のミトコンドリア膜電位は、5つのテストグループで解凍後に大幅に減少し、グループEで最小の減少がありました。これは、他の4つのテストグループよりも有意に低かった。

ディスカッション

凍結保護剤は、浸透性および不浸透性として分類することができます。 最も一般的に使用される不浸透性凍結防止剤は、スクロースとD ()-トレハロース二水和物です。 以前の研究では、スクロースまたはD ()-トレハロース二水和物を凍結防止剤に添加すると、アカゲザルまたはマウスの精巣胚芽細胞の回復率が大幅に増加する可能性があることが確認されています。

上記の研究の結果は、0.1 mol/Lスクロースまたは0.1 mol/L D ()-トレハロース二水和物を凍結保護剤に添加すると、細胞の凍結保存に一定の保護効果があることを示しました。0.1 mol/Lスクロースと0.1 mol/L D ()-トレハロース二水和物を同時に添加すると、解凍後の凍結保存されたマウス精巣細胞の回復率が大幅に増加しました。 アポトーシス速度を低下させ、凍結保存によって引き起こされるミトコンドリア膜電位への損傷を減少させました。

ただし、DMSO濃度の上昇 (15%) によって引き起こされる細胞毒性は、スクロースおよびD ()-トレハロース二水和物の凍結保護効果を部分的に相殺します。